滤光片在共聚焦显微镜上的作用

2016-05-18技术资料

由于对孔径的独特的布置,共聚焦显微镜探测器所提供的图像对应于一个薄的光学切片或是样品的截面。例如,一个几毫米厚的样品在焦平面处沿z轴降至少于微米。

共聚焦处的光照场通过一个被称为针孔的孔径所限制。视场同样也受到一个针孔的限制,针孔的位置是相对于第一个孔径与照射点共轭的像平面上。这种共聚焦配置的结果就是降低了对散焦光的探测,从而通过减少成像容积来增加信噪比。

Marvin Minsky首先设计了共聚焦显微镜并在1957年的一份专利中描述了一个通过移动照射光束平台来实现的。从样品发来的调制光被送往光电管用示波器观察。光照射及随后的探测是通逐点地过移动平台来实现的。Minsky的极具原创性的构想最终彻底改变了显微镜。

Minsky的专利被通过的时候,还是存在有几个技术难点。由于限制孔径,他的系统需要非常强的光源。鉴于由针孔损失的光强,在当时激光并不存在,并且也没有其他足够强的光源来激发荧光。在那时候Minsky使用的是长期持久的示波器做观测,因此没有办法如实记录图像。导致其他发明者对这一特殊的显微镜做进一步的发展成为对普通研究者的有效工具。

发展强烈的单色光源—激光—解决了照射的问题。计算机装备了数字化仪之后,使记录和现实图像变得轻而易举。如今,现在扫描共焦使用激光或结合激光作为照射光源。这种扫描是通过精确控制振镜以光栅运动的方式,用最小光斑扫过视场,就像通过电脑控制电视一样。从样品散射或反射的荧光信号被发送到光电倍增管(PMT),这是一次形成图像在屏幕上的一个点(像元素、像素点)。

虽然Minsky罗列了共聚焦的许多优点,或许最重要的功能就是扫描共聚焦显微镜能够对样品进行光学截面成像。传统上,通过固定组织然后仔细地将其切片成以便观察和成像的薄层,来获取细胞或组织的精细结构。这个过程需要将样品处死,并且需要研究人员花费好几年时间去学习切片技术才能将样品切割到成像所需的足够薄的厚度。

共聚焦的光学切片性能允许用户对厚组织成像而不需要特殊的切片技巧。它还允许用户对活的细胞、组织以及生物体进行超高分辨率成像。活体细胞成像已经成为共焦显微镜的一个重要组成部分。

这种光学切片的能力也意味著单张切片/图像可以保存到计算机,然后还可以将图片重组为样品的三维图像。这在现有的激光扫描系统中是非常重要的特征。

此系统在荧光成像中会采用一些特殊的光学元件。一个常见的误解认为激光器产生的激光输出只有一个波长。实际上几乎所有的激光器都将产生谐波或散射其他波长光。虽然这些次波段的光跟主波段相比强度很弱,但是他们还是可以大大降低信噪比。如果荧光的发射波段正好落在激光谐波的范围内(或是来自激光的其他杂光),那么荧光信号可能会完全被掩盖掉而探测不到。

光路中的首要器件就是激光纯化滤波片,这就是经修饰过的激发光滤波片。由于激光的相干性和相对较小的光束以及光路准直的要求,这些镜片都是要经过研磨和抛光处理的。这就与宽场显微镜形成鲜明的对比,因为宽场显微镜不需要研磨和抛光。纯化镜片还应具有很好的传输特性,包括波前畸变要少于每英寸一个波长。偏离角(与镜片外缘理想平行线的偏差)应尽量减小到小于一个弧度角分,这样在同一个系统中使用不同纯化滤波片的时候就不必重新矫正了。

一个纯化滤波片的半波宽度(FWHM)通常是在10nm左右。它会阻塞激光光源的其他杂光(最大范围会从紫外光到1200nm)和减反射涂层来达到最大传输。

随着更新、更强的激光器的出现,利用增透膜来增加透过率就显得没有必要了。然而,这些光学器件采用最大反射的干涉涂层以避免热损伤,增透膜将因此减少表面反射。这些反射光不能被反射进入激光器的共振腔。因此,这些光件被设计用于入射角(AOI)在3.5度到5度之间。二极管激光器在热身之后所发射的光的波长会有轻微的变化,因此,我们建议为这些光源配备20-25nm宽的纯化滤波片。在共聚焦系统和普通荧光显微系统中,为了获得较好的平面平整度,它们必须克服波前像差。虽然两种系统的波前像差都控制在每英寸一个波的范围内,但在共聚焦系统中选择二向色镜显然可以获得更好的效果。

目前,要4-6m厚的熔融石英基片上实现二向色性已经很常见了,但越来越多的需求需要用更厚的基片来消除波前像差并实现二向色性。

在过去几年时间里,随着激光器的规模做得越来越大,也会有这些越来越大的功率负载可能会摧毁主镜方面的担心。这对于设计良好的二向色镜来说不成问题,对常见大小的光束负载至少达到8-10瓦特的功率。通过增透膜来最大限度的减小聚束光的反射使透射率最大化。

偏振也是滤镜要考虑的另一个因素。因为所有的光件对光路有偏转角度时都可以充当偏振镜,这对大多数偏振激光来说就显得尤为重要。

所有荧光发射滤镜的主要作用就是阻止激发光的透过。相比较于荧光显微镜而言,对于共聚焦系统,这种阻塞并不包含很宽的光谱范围。然而,由于激光束的高功率输出,需要对激光发射的特定波长专门设计更大的阻塞(或许高于OD 8)。

对共聚焦系统发射滤镜的实际设计还是存在一些争议。由于大多数探测器采用光电倍增管(PMT),图像一次采集只形成一个像素(图像元素),这些滤镜光件就不需要打磨和抛光。但由于共聚焦成像对分辨率的要求越来越高,就像其他发射滤波片一样经过打磨和抛光并不是在浪费精力。近期一些证据表明,发射滤波片具有较大楔形时(光束变差)可能会造成形态学测量的不准确,这种不准确在长发射光路中可能会更严重。

激光系统的滤波片光具座是围绕激光发射而设计的,并不一定针对特定荧光染料的最大或激发。这确实带来有关的几个问题,什么样的荧光染料才适合特定的激光系统。幸运的是,现在从荧光染料的供应商那里可以获得更多的选择了。另外也可以选择使用可以方便和快速反射多个激光束的多色主镜。