相差显微镜的使用方法

相差显微镜关键的四步使用方法

第一步：光源的选择

相差显微镜观察的光源要满足三个Zui基本条件：第一，为较强的光源。因为在相差显微镜中环状光阑限制了相当数量的光能进入成像光路。位相板还要吸收掉直射光的60～90%。库列照明方法是满足这一条件的Zui有效措施。第二，必须吸收掉光源的热辐射线。因为相差显微镜下观察的对象中主要是生活状态下的活细胞。在光路上设置除热滤光片或吸热水层可以满足去热条件。第三，单色光光源能够保证正确调整生物标本的折射率差异。在光源前附加绿色滤光片足以解决这一条件。

库列照明方法（参照图1）的第一步，要放置标本，调好焦距。其次确定光源的位置。使用传统显微镜时，要把照明灯放置在适当的距离上，使光源会聚镜的焦面对在孔径光阑的平面上。具体操作是：在孔径光阑上放置磨砂破片。当照明灯的位置适当时，在磨砂玻片上看到灯丝的影像。当使用内装光源的显微镜时，灯光的距离只能用会聚镜的位置加以调整。

其次调整孔径光阑的孔径。为此目的，首先缩小孔径光阑，其次拔掉目镜，利用对焦望远目镜逐渐开大孔径光阑，使其边缘适与物镜口径相对应。

这两步操作完成后即可使用显微镑。库列照明法的Zui重要优点是照明光线充足均匀，并消除散射光的干扰。

第二部：标本

相差显微镜观察的标本基本上是未染色生物标本，或生活状态下的生物标本。观察这类标本时培养瓶壁、载玻片、盖玻片等一切插入光路的物体的厚薄要均匀，介面要平整，否则致使光路畸变，抵消标本细节的位相差即光程差。

第三部：校对光栏和相板的共轭面

相差显微镜的使用方法中Zui关键性操作就是使环状光阑的亮环与位相板的共轭面(暗环)相对准。绝不能相互偏离，也不能大小不一。如果校对不准确．要泄漏直射光，破坏相差效果。

为了校对共轭面，首先作到光源照明正确，放置标本，调好物镜焦距，而后拔掉目镜，换插校正望远月镜。将望远目镜的接目透镜简(内层管)向外抽出。抽到能看清环状光阑的亮环和位相板的暗环为止。用固定螺旋把接目镜镜筒固定在此位置上，边观察边调推共轭面。

如果看到图2所示环状光阑的亮环大于位相板的暗环，或像B所示前者小于后者时，要用聚光镜的升降来调整大小。当看到D所示二者偏移时，用环状光阑合轴调节螺旋调到光路中心。一旦出现C所示的情况，即视野半边亮另半边暗时，调光源光轴。共轭面的正确调整以图E为准。有时出现多层亮环、暗环、圈套圈的情景。这就考虑环状光阑是否处于聚光镜的前焦面上，光源的距离是否合适等问题。校准之后拔掉校正望远目镜，安放原来的目镜，进行观察。

第四步：正确选用位相板

有些文献中往往用缩写代表某种位相板。例如PM全文是positive meium，即暗反差(正反差)吸光率中度位相板。NH的全文是negative high，即明反差(负反差)吸光率高。DL代表dark low，暗反差低吸收率，BM代表bright medium，明反差中度吸收率。

位相差观察时在什么样条件下应该用什么种类的位相板问题，无法作出定论。因为标本的各种细节的折射率各不相同。情况变化复杂，无法固定一些条件。但是大体上可以说标本细节与介质问反差显著时，可用低吸收率位相板，而反差小时，用高吸收率位相板。物体形体大时用低相板，而物体过小时用高相板。